Обіцянки і загрози CRISPR

З’явилася потужна і дуже дешева технологія редагування генів, яка потенційно здатна змінити біологію і медицину. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, "Короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами") має надзвичайно широку сферу застосування – від лікування невиліковних генетичних захворювань, ліквідації цілих популяцій збудників небезпечних інфекцій й до створення генетично модифікованих зернових культур і продуктів тваринництва. Але разом з гігантським потенціалом технології йдуть і значні небезпеки.

 

 

Брюс Конклін, генетик з Інституту Ґладстоуна в Сан-Франциско (Каліфорнія), протягом багатьох років досліджував, як розбіжності в ДНК зумовлюють різні захворювання у людей, але засоби, які він використовував в своїх дослідженнях, були досить дорогими і громіздкими. Часто було дуже важко дізнатись, які генетичні послідовності пов’язані з захворюванням, а які є всього-на-всього фоновим шумом. А створення клітинних мутацій потребувало надто багато коштів і праці. «Щоб змінити лише один ген, потрібно було докласти стільки зусиль, скільки, наприклад, потрібно студентові, щоб написати дипломну роботу», - каже вчений.

 

Ситуація змінилася у 2012 р., коли Конклін прочитав щойно опубліковану статтю з описом нової технології, названої CRISPR, яка обіцяла швидко і легко змінювати ДНК майже будь-якого організму, зокрема людини. Тож він не завагався відкласти старі методи і спробував використати цей. Тепер редагування генів, пов’язаних з різними захворюваннями, в його лабораторії поставлене майже на конвеєрну основу: CRISPR, за його словами, «перевернув все з ніг на голову».

 

В науковому світі багато хто поділяє такі почуття. CRISPR зумовив небачений підйом в біомедичних дослідженнях. На відміну від інших методів редагування генів, він дешевий, швидкий та простий у використанні. Тож безліч лабораторій у всьому світі не забарилися взяти його собі на озброєння. Дослідники плекають амбітні плани широкого використання цієї технології для викорінення хвороб, створення нових сортів рослин і тварин та знищення шкідливих патогенів. «За свою наукову кар’єру я бачив тільки два великі прориви в генній інженерії – CRISPR та PCR», - каже Джон Шіменті, генетик з Корнельського університету в Ітаці (Нью-Йорк). Як і PCR – полімеразна ланцюгова реакція (метод збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК , який революціонував генну інженерію після відкриття у 1985 р.), – CRISPR, за його словами, «впливає на науку багатьма способами».

 

Але хоча очікування, покладені на CRISPR, дуже великі, багато вчених стурбовані тим, що поспіх і ентузіазм залишає надто мало місця для етичних та безпекових питань, які пов’язані з такими експериментами. На публічний рівень ці питання потрапили в квітні минулого року, коли в новинах стала ширитися інформація, що вчені використали CRISPR для редагування людських ембріонів. І хоча ці ембріони були нежиттєздатними, почалися серйозні дебати про те, чи можна використовувати CRISPR для створення спадкових змін в людському геномі. Є ще й інші побоювання. Деякі вчені закликають додатково дослідити те, чи CRISPR здатен викликати побічні і потенційно небезпечні зміни геному. А інші бояються того, що генетично модифіковані організми можуть порушити цілі екосистеми.

 

«Ця технологія неймовірно доступна. Вам не потрібно ані дорогого обладнання, ані багаторічної підготовки персоналу, щоб проводити такі досліди. А це, своєю чергою, змушує не раз, а двічі подумати над тим, як ми використовуватимемо цю силу», - каже біолог зі Стенфордського університету (Каліфорнія) Стенлі Ці.

 

Потрібно наголосити, що редагування геномів вже давно не є останнім словом в науці. Приблизно десять років тому вчених захопили ензими, названі «нуклеазами цинкового пальця», які обіцяли здійснювати цю процедуру акуратно і ефективно. Але набір «цинкових пальців» коштує дуже дорого – понад 5,000 $. Через значну ціну і складність застосування ця технологія так і не набула значного поширення, – каже Джеймс Габер, молекулярний біолог з Брендейського університету в Волтемі (Массачусетс). CRISPR працює по-іншому. Він використовує ензим Cas9, який скеровує молекули РНК на ДНК-мішені, а згодом редагує ДНК, усуваючи небажані гени або утворюючи нові послідовності. Дослідникам потрібно замовити лише бажаний фрагмент РНК, а всі інші компоненти доступні біологам досить легко. Загальна вартість процедури не перевищує 30$. «Це ефективно демократизує технологію. Тепер кожен може її використовувати. Це велика революція», – каже Хабер.

 

Методика CRISPR швидко відтісняє «цинкові пальці» та інші засоби редагування геному. Для багатьох науковців це рівнозначно відмовитись від технологій, над удосконаленням яких вони працювали багато років свого життя. «Я, звичайно, розчарований, але мене дуже захоплюють потенційні можливості нового методу», - каже Білл Скарнз, генетик з Wellcome Trust Sanger Institute у Гінкстоні (Сполучене Королівство). Скарнз потратив більшу частину своєї кар’єри, удосконалюючи технологію впровадженнія ДНК в ембріональні стовбурові клітини гризунів та використання цих клітин для отримання генетично модифікованих особин. Ця техніка за останнє десятиліття вже стала«робочою конячкою» в лабораторіях, але вона також дорога та потребує багато часу. CRISPR натомість дешева та швидка, тож два роки тому Скарнз перейняв її для своїх розробок.

 

В генетичних дослідженнях вчені традиційно покладалися на модельні організми, такі як миші та фруктові мушки, адже їх ДНК чудово придатні для генетичних маніпуляцій. CRISPR же дозволяє редагувати гени в набагато більшої кількості організмів. У квітні минулого року, наприклад, дослідники з Інституту біомедичних досліджень ім. Вайтхеда у Кембриджі (Массачусетс) повідомили про використання CRISPR для вивчення Candida albicans – грибкової інфекції, яка є смертельно небезпечною для людей з ослабленою імунною системою і якою досі було дуже важко маніпулювати в лабораторії. Дженіфер Дудна, піонер вивчення CRISPR з Каліфорнійського університету (Берклі), веде список редагованих за допомогою цієї технології організмів. Сьогодні у цьому списку вже понад тридцять записів, починаючи від трипаносом – збудників небезпечних паразитарних захворювань – й до дріжджів, які використовують у виробництві біопалива.

 

Утім, стрімкий прогрес має свої недоліки. «Прогрес елементарно не залишає часу, що охарактеризувати деякі базові параметри системи», - каже Бо Хуань, біофізик з Каліфорнійського університету в Сан-Франциско. «Чомусь є такий підхід, що поки щось працює, знання того, як і чому воно працює, є другорядним», - додає науковець. Як наслідок, час від часу дослідники наштовхуються на різні перешкоди. Хуань та його співробітники марно намагалися протягом двох місяців адаптувати CRISPR для медичної візуалізації. Він підозрює, що затримка могла б бути коротшою, якби попередньо було проведено більше досліджень керуючої РНК.

 

Є й серйозніші побоювання. Дослідники використовують у різних цілях CRISPR, часто не тямлячи, які можуть бути наслідки, якщо експерименти вийдуть з-під контролю. Так, у 2014 р. Дженіфер Дудна побувала на презентації дослідження, автор якого запрограмував вірус, аби він ніс компоненти CRISPR до мишей. Миші вдихали вірус, а мутації відтворювали у них модель людського раку легень. Дослідниця неабияк перелякалася: найменша помилка в дизайні керуючої РНК могла створити CRISPR, який би викликав цю саму патологію у людей! Якби з якихось причин цей вірус вирвався з лабораторії, наслідки могли б бути катастрофічними.

 

Автор цього дослідження Андреа Вентура з Центру вивчення раку ім. С. Кеттерінга в Нью-Йорку стверджує, що він та його співробітники напрочуд уважно підійшли до питань безпеки: керовані частинки могли вражати ділянки геному, які є лише у мишей, а у вірусу вимкнули функцію реплікації. Однак все-таки він погоджується, що важливо передбачати навіть далекі ризики.

 

Минулого року біоінженер Денієл Андерсон з Массачусетського технологічного інституту в Кембріджі використав CRISPR, щоб виправити в гризунів мутацію, пов’язану з метаболічною хворобою тирозінемією. Уперше за допомогою CRISPR вдалося виправити мутацію, яка викливає серйозне захворювання, що, очевидно, є важливим кроком до майбутнього використання цієї технології в людей. Потрібно наголосити, що цей експеримент вказав ще й на недоліки CRISPR, адже щоб доставити ензим Cas9 та його керовану РНК в орган-ціль – печінку, – команді довелося напомпувати велику кількість рідини в судини, що цілком могло б вбити людину. При цьому відкорегувати мутацію вдалося лише в 0,4% клітин, чого не достатньо для впливу на більшість хвороб.

 

Утім чимало компаній вже взялися розробляти генну терапію на основі CRISPR. Андерсон переконаний, що клінічні випробування цієї технології можуть розпочатися вже за рік -два. У цих перших випробуваннях, мабуть, компоненти CRISPR вводитимуть безпосередньо в тканини (наприклад, в око), або з тіла пацієнта вийматимуть клітини, оброблятимуть їх в лабораторії за допомогою CRISPR та повертатимуть назад. Технологія дозволяє корегувати стовбурові клітини для боротьби з такими синдромами, як серповидноклітинна анемія або β-таласемія. Спрямовувати ензим та керовані РНК в різні тканин буде серйозним викликом, але дослідники сподіваються, що одного дня ця технологія дасть змогу переборювати значну кількість генетичних хвороб.

 

Сьогодні вченим потрібно збільшити ефективність редагування, але при цьому упевнитись, що вони не запроваджують змін десь-інде в геномі, що можуть мати наслідки для здоров’я. «Ці ензими можуть врізатися в гени і в інших місцях, а це має багато наслідків. Якщо ви хочете замінити чийсь ген серповидоклітинної анемії в стовбуровій клітині, вам потрібно задати питання: “А які ще зміни ви можете зробити на іншому боці геному?”, – каже Хабер.

 

Дослідник Кіт Джоун, дослідник генної інженерії з Загальної клініки Массачусетса, вже почав розробляти методи полювання на Cas9 за межами його цілей. За його словами, частота таких відхилень варіюється від клітини до клітини й від однієї послідовності до іншої. У своїй лабораторії він спостерігав різні випадки відхилення Cas9, що траплялися з частотою від 0,1% до 60%. Вчений наголошує, що навіть випадки з низькою частотою є потенційно небезпечними, адже можуть викликати неконтрольований ріст клітин, що викликає рак.

 

З такою кількістю запитань без відповідей важливо тверезіше ставитися до очікувань щодо CRISPR, – каже Кетрін Бослі, головний виконавчий директор Editas, компанії в Кембриджі (Массачуссетс), яка розробляє способи терапії за допомогою цієї методики. Бослі – ветеран комерціалізації нових медичних технологій. Вона каже, що в її роботі, як правило, найскладніше переконати інших, що новий підхід працюватиме. «З CRISPR якраз навпаки. – каже вона. – Є так багато ентузіазму і підтримки, що нам, навпаки, потрібно дивитися на це більш реалістично».

 

Багато дослідників розглядає CRISPR передусім в медичних цілях, але є й ті, яких цікавлять можливості нової технології в сільському господарстві. Раніше, як правило, генетичне редагування здійснювалося шляхом впровадження гену в геном у випадковій послідовності разом з послідовностями бактерій, вірусів та інших видів, які зумовлюють експресію генів. Цей процес завжди давав щедру «їжу» для критиків, яким не давав спокою процес змішування зразків ДНК різних видів і які переживали за те, що таке впровадження може зашкодити іншим генам. Крім того, отримання дозволу на використання генетично модифікованих сільськогосподарських культур є таким складним та дорогим, що модифікують як правило, тільки ті культури, які вирощують у великих промислових масштабах, наприклад кукурудзу чи сою.

 

З CRISPR ситуація може змінитися: легкість та низька вартість можуть дозволити генетично модифікувати менші, спеціалізовані культури, а також тварин. В минулі роки дослідники використали цей метод, щоб створити мініатюрних декоративних свинок (teacup pigs) та рис і пшеницю з імунітетом від багатьох хвороб. Крім того, селекціонери досягнули прогресу в напрямку створення худоби без ріг, кіз з посиленим імунінетом та насичених вітамінами солодких апельсинів.

 

Здатність CRISPR точно редагувати послідовності ДНК дозволяє отримувати лише бажані мутації, але при цьому ускладнює ідентифікацію генетично модифікованого організму. «Ця технологія, по суті, позбавляє нас фактичної можливості справді відстежувати генетично модифіковані продукти», – каже Дженіфер Кузма, дослідниця з Університету Північної Кароліни. «Тепер нам буде дуже важко визначити, чи якась тварина чи рослина мутувала сама собою, чи її генетично змінили».

 

Як наслідок, противники генетично модифікованих культур б’ють на сполох. Значні запитання виникають і в законодавців в країнах, які створюють закони, що регламентують генетично модифіковані організми. В Сполучених Штатах, наприклад, Управління продовольства та медикаментів (Food and Drug Administration) має надавати свій дозвіл на використання будь-якого генетично модифікованого продукту рослинного чи тваринного походження для споживання людьми. Досі воно ще не оголосило про свою офіційну політику стосовно CRISPR, але очікують, що таке рішення не забариться.

 

Окрім боротьби з недугами і фермерства, CRISPR має ще важливу сферу застосування у дикій природі. Сьогодні багато уваги звертають на метод, що називається gene drive. Gene drive може швидко передавати редагований ген цілій популяції організмів. Робота над ним сьогодні перебуває на ранніх стадіях, але вона потенційно дозволяє знищити цілі види москітів і кліщів, що переносять небезпечні хвороби, а також інвазивні рослини, наприклад стійкий до гербіцидів амарант, що приносить чимало клопотів американським фермерам.

 

Генетична зміна в одному організмі, як правило, потребує дуже багато часу перш ніж поширитися всередині цілої популяції. Причиною цього є те, що мутація, яку несе одна з пари хромосом, успадковується лише половиною потомства. Суть методу gene drive полягає в тому, що ця мутація копіюється і в хромосому партнера, тож мутацію успадковує усе потомство, яке несе її надалі. Як наслідок, мутація поширюватиметься в популяції набагато швидше, ніж це відбувається за нормальних умов. Наприклад, у малярійних москітів згубний ген можна буде передати цілій популяції лише за один сезон. А разом з москітами можна буде знищити і збудника малярії, який вони переносять.

 

Вчених, щоправда, дуже лякає те, що генетична модифікація чи знищення цілої популяції організмів в дикій природі може мати невідомі наслідки для екосистеми. Можливо, це зумовить появу інших форм шкідликих істот або вплине на хижаків, розташованих вище на ланцюгу харчування. Крім того, відомо, що керована РНК сама з часом може мутувати та вразити якусь іншу частину геному, що, очевидно, матиме непередбачувані наслідки.

 

«Ціна таких експериментів дуже висока, адже вони є незворотними», – каже Джордж Черч, біоінженер з Гарвардської медичної школи в Бостоні. У квітні 2014 р. Черч опублікував статтю в журналі Science, в якій застеріг проти випадкового потрапляння в природне середовище експериментальних gene drives та описав заходи безпеки проти цього.

 

Два роки тому gene drives здавалися далекою перспективою. Але вже за рік еволюційний біолог Етьєн Бір з Каліфорнійського університету в Сан-Дієґо та його студент Валентіно Ґанц повідомили, що створили першу таку екосистему плодових мушок. Бір і Ґанц утримували створену популяцію в потрійному контейнері та дотримувалися таких заходів безпеки, які зазвичай використовують під час роботи з найнебезпечнішими патогенами. Однак вони все-таки не дотримали усіх заходів безпеки, визначених Черчем, зокрема не розробили методики обернення генетичних змін.

 

Для Черча та його однодумців це був перший сигнал, що демократизація редагування геному за допомогою CRISPR може мати неочікувані та небажані наслідки. «Дуже важливо, щоб національні регуляторні власті та міжнародні організації якнайшвидше зайнялися цим питанням, причому дуже серйозно», – каже Кеннет Ай, політичний експерт з Массачусетського технологічного інституту. Ай занепокоєний тим, що наука розвивається зі швидкістю світла, а регуляторні заходи можуть вступити в силу лише після якогось катаклізму, пов’язаного з викидом gene drive в природне середовище.

 

Мікі Ебанкс, еколог з Техаського університету в Коледж-Стейшн, стверджує, що ідея gene drives спершу його шокувала. «Моя перша реакція була “О, Боже, це жахливо”. Але коли я ретельніше все зважив, то, взявши до уваги ті зміни в довкіллі, які ми вже зробили, це буде крапля в морі», – каже він.

 

Інші дослідники розглядають CRISPR у світлі інших технологій, які спершу викликали великий ентузіазм, але згодом з ними прийшли побоювання й розчарування. Медичний генетик Джеймс Вілсон з Пенсильванського університету у Філадельфії у 1990-х, наприклад, був одним з піонерів впровадження генної інженерії у клінічні дослідження. Але ці експерименти швидко були припинені, коли одне з випробувань пішло не так й зумовило смерть молодої людини. Лише зараз увага до цієї сфери почала відроджуватися. CRISPR – це дуже молода технологія, каже Вілсон, і мають пройти роки, перш ніж збагнуть її потенціал.

 

Однак згодом Вілсона знову «вкусила комашка» CRISPR. Він каже, що спершу скептично ставився до обіцянок цього методу, аж поки не почав використовувати його у своїй власній лабораторії. «Це достеменно матиме роль в людській терапії. Це дуже вражаюче», – каже вчений.  

 

 

Heidi Ledford

CRISPR, the disruptor

Nature, 3/06/2015

Зреферував Євген Ланюк

07.05.2016